Comparação das soluções de criopreservação e métodos de sincronização do ciclo em G0/G1 de fibroblastos de onças-pardas, Puma concolor (Linnaeus, 1771)

Abstract

A ameaça ao quantitativo populacional de onças-pardas, atrelada a sua importância ecológica, resultam no desenvolvimento de estratégias como os bancos de recursos somáticos. Esses bancos atuam na preservação de células somáticas, as quais podem ser empregadas em estudos de produção de células pluripotentes e crias clones. Neste contexto, o estabelecimento de condições de criopreservação e sincronização do ciclo celular são etapas importantes na qualidade destes bancos. Portanto, o objetivo foi comparar soluções de criopreservação em células somáticas e avaliar metodologias de sincronização do ciclo em G0/G1. Para tanto, fibroblastos derivados da pele de três animais foram cultivados até a 3ª passagem e submetidos aos experimentos. No primeiro experimento, células foram criopreservadas utilizando diferentes soluções compostas por etilenoglicol e dimetilsulfóxido em duas concentrações (2,5% e 10%), na ausência e presença de 0,2 M de sacarose e avaliadas quanto à morfologia, viabilidade, atividade metabólica, análise proliferativa e níveis de apoptose. Células não criopreservadas foram usadas como controle. No segundo experimento, células foram submetidas a três técnicas de sincronização em diferentes tempos: inibição por contato (IC) (24, 48 e 72 h), privação de soro (PS) (24, 48, 72 e 96 h) e roscovitina (RO) (12 e 24 h). Células não sincronizadas foram usadas como controle. Neste experimento, células foram avaliadas quanto ao ciclo por citometria de fluxo e viabilidade e níveis de apoptose por ensaios microscópicos. No primeiro experimento, nenhuma diferença foi observada entre as diferentes soluções de criopreservação para nenhum dos parâmetros. Os valores de viabilidade e atividade metabólica variaram de 79,1% ± 8,3 a 91,5% ± 0,6 e 87,2% ± 5,4% a 99,9 ± 0,1, respectivamente. Adicionalmente, para a análise proliferativa, os valores variaram de 43,3% ± 9,7 a 92,7% ± 28,2. Quanto aos níveis de apoptose, os resultados variaram de 68,0% ± 7,4 a 80,0% ± 3,8 em células viáveis, 10,0% ± 2,5 a 18,0% ± 4,9 em células em apoptose inicial, 2,0% ± 0,8 a 8,0% ± 1,6 de células em apoptose tardia e 3,0% ± 0,7 a 9,0% ± 3,4 de células em necrose. No segundo experimento, fibroblastos submetidos à IC por 24 h (84,0% ± 1,8) e 48 h (84,6% ± 0,6) apresentaram um maior percentual de G0/G1, quando comparados ao controle (73,9% ± 3,0). Já aqueles submetidos a PS, somente o tempo de 96 h foi hábil para a sincronização em G0/G1 (85,4% ± 3,4) quando comparado ao controle (73,9% ± 3,0). Além disso, RO por 12 h (78,6% ± 3,5) e 24 h (82,1% ± 4,5) não foi capaz de sincronizar células. As taxas de viabilidade em todos os grupos variaram de 76,8% ± 6,7 a 96,0% ± 2,8. Para os níveis de apoptose, foi observado que IC e RO não afetaram esses parâmetros (P>0,05). Contudo, PS causou diferenças quanto as células viáveis e necróticas no tempo de 96 h (P<0,05). Em conclusão, fibroblastos de onças-pardas podem ser criopreservados utilizando ambos os crioprotetores intracelulares, em concentrações reduzidas, e na presença ou ausência de sacarose. Ainda, a IC se mostrou mais eficiente para a síncronização em G0/G1, sendo este estudo uma importante etapa elucidada visando o emprego dessas células para a conservação da onça-parda.