Cultivo, criopreservação e sincronização do ciclo celular de fibroblastos e produção in vitro de embriões como ferramentas para a conservação do preá-da-caatinga (Galea spixii Wagler, 1831)

Abstract

A conservação de espécies silvestres requer a integração de estratégias celulares e reprodutivas que ampliem a preservação do material genético e o avanço das biotecnologias aplicadas. Nesse contexto, os fibroblastos são utilizados em estudos de cultivo, criopreservação, e sincronização do ciclo visando aplicações em biotecnologia reprodutiva. Paralelamente, a maturação e ativação in vitro de oócitos constitui uma ferramenta essencial para espécies não convencionais, ainda carentes de protocolos padronizados. O preá-da-caatinga (Galea spixii), um roedor silvestre neotropical de interesse científico e conservacionista, apresenta lacunas metodológicas que justificam o desenvolvimento de abordagens integradas para sua conservação. Portanto, este estudo objetivou avaliar estratégias celulares e reprodutivas envolvendo a obtenção, criopreservação e sincronização do ciclo em G0/G1 de fibroblastos, bem como as condições de maturação e ativação de oócitos em G. spixii. Para tanto, a pesquisa foi conduzida em quatro etapas. Na primeira etapa, linhagens de fibroblastos foram avaliadas nas 2ª, 5ª, 8ª e 10ª passagem, bem como quanto à criotolerância após congelação lenta usando 10% DMSO e 0,2 M sacarose. Nesta etapa, observou-se que, embora células viáveis tenham sido identificadas até a 10ª passagem, fibroblastos na 5ª passagem apresentaram maior estabilidade morfológica, genética e fisiológica. Contudo, a criopreservação induziu alterações ultraestruturais e fisiológicas, evidenciando a necessidade de otimização dos protocolos. Na segunda etapa, objetivou-se otimizar a eficiência da criopreservação por meio da adição de L-prolina (LP), um aminoácido com ação osmoprotetora, em substituição parcial aos crioprotetores convencionais. Para tanto, fibroblastos foram criopreservados em quatro condições: Grupo A (Controle, não submetidos à criopreservação), Grupo B (10% DMSO e 0,2 M sacarose), Grupo C (10% DMSO e 5 mM LP) e Grupo D (10% DMSO, 0,2 M sacarose e 5 mM LP). A adição de LP (Grupos C e D) mostrou-se mais eficaz que o uso isolado de sacarose (Grupos A e B), resultando em maior viabilidade celular, menor dano fisiológico e redução de espécies reativas de oxigênio, com melhor atividade mitocondrial, evidenciando menor estresse celular. Na terceira etapa, fibroblastos foram submetidos à diferentes condições de sincronização do ciclo em G0/G1: roscovitina (RSV; 7,5; 10; e 15 μM por 6–24 h) ou privação de soro fetal bovino (PSFB; por 24–96 h). Embora 15 μM de RSV por 12 h tenha gerado 91,55% ± 1,20 das células em G0/G1, as concentrações 7,5 μM (89,87% ± 1,70; 96,17% ± 1,27) e 10 μM (90,01% ± 0,84; 92,22% ± 1,92) alcançaram melhor equilíbrio entre sincronização e apoptose em relação às células não submetidas a nenhum protocolo de sincronização (86,33% ± 0,73; 97,89% ± 0,34). A PSFB manteve 95,3% ± 0,7 de viabilidade após 24 h e 90,3% ± 1,1 das células em G0/G1, embora apresentasse perda de colônia, aderência e aumento de apoptose após 48 h. Na quarta etapa, oócitos foram avaliados quanto às condições do meio de maturação (primeiro experimento) e ativação artificial (segundo experimento). Nesse contexto, oócitos maturados na presença de 10 ng/mL EGF apresentaram maior viabilidade das células do cumulus e melhor qualidade morfométrica quando comparados àqueles expostos a 50 ng/mL. Adicionalmente, observaramse taxas de maturação nuclear entre 55% e 64%, com extrusão do primeiro corpúsculo polar, e de 50% a 63% de oócitos em metáfase II. Posteriormente, embora não tenham sido observadas diferenças nas taxas de mórulas, a ativação de oócitos com 10 mM SrCl₂ por 2,5 h, seguida da exposição a 5 μg/mL citocalasina B e 2 mM 6-DMAP por 3,5 h, resultou na maior taxa de clivagem (69,3% ± 5,0%) quando comparada à ativação realizada na ausência de 6-DMAP (53,5% ± 3,5). Por fim, fibroblastos foram isolados, criopreservados e sincronizados eficientemente, enquanto a produção in vitro de embriões apresentaram parâmetros favoráveis, reforçando o potencial da espécie como modelo biológico.