Avaliação das técnicas de criopreservação da pele e cartilagem auricular apical de Galea spixii (Wagler, 1831)

Abstract

A ordem Rodentia é constituída por uma variedade de espécies de pequeno a grande porte, e destes, o Galea spixii é um representante de importante papel ecológico, econômico e científico. Buscando contribuir para a conservação e conhecimento da espécie, bancos de tecidos somáticos representam um passo significativo para o uso destas amostras como estratégias de conservação, sendo o estabelecimento adequado dos protocolos de criopreservação tecidual a primeira etapa da formação destes bancos. Portanto, o objetivo foi comparar duas técnicas de criopreservação tecidual (vitrificação em superfície sólida vs. congelação lenta) na conservação de tecidos somáticos de G. spixii. Para tanto, tecidos somáticos derivados de biópsias do pavilhão auricular apical de quatro G. spixii machos e adultos pertencentes ao Centro de Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS/UFERSA) foram coletados, e transportados ao laboratório em meio essencial mínimo modificado por Dulbecco (DMEM) acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB) e 2% de solução de antibióticos­antimicótico. No laboratório, as amostras foram tricotomizadas, fragmentadas em 9,0 mm3 e distribuídas, aleatoriamente, entre os grupos: i) grupo controle (não criopreservado); ii) vitrificação em superfície sólida (VSS) e iii) congelação lenta (CL). Para a CL, DMEM em associação a 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), 10% de SFB e sacarose (SAC; 0,2 M) foram empregados como solução de criopreservação, enquanto para a VSS, 3,0 M de DMSO em associação a 3,0 M de etilenoglicol (EG) e 0,25 M de SAC foram empregados. Tecidos somáticos foram avaliados quanto às suas características morfológicas, morfométricas e proliferativas por técnicas histológicas. Além disso, fragmentos foram submetidos ao cultivo primário, onde foi observada a viabilidade, atividade proliferativa e metabólica, e níveis apoptóticos das células recuperadas. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão, considerando um animal/uma repetição. Os dados foram analisados pelo software GraphPad, considerando P < 0,05. Para a análise da espessura da pele, apenas a córnea sofreu alteração após a criopreservação por VSS (0,99 ± 0,31 μm), quando comparada ao controle (0,81 ± 0,16 μm). Já na epiderme, derme e pele total, não foi verificado diferença entre os grupos avaliados. Em relação à quantificação celular, a VSS (77 ± 17,8) se mostrou similar ao controle (81 ± 18,9) quanto ao número de células da epiderme, enquanto a CL (22 ± 3,93) apresentou um maior número de halos perinucleares quando comparado ao controle (19 ± 3,97). Na derme, o número de fibroblastos manteve­se similar entre os grupos experimentais, apesar da técnica por CL ter apresentado um menor percentual de fibras colágenas. Após a avaliação da cartilagem, foi observado que a VSS continha um maior número de condrócitos degenerados. Contudo, a CL apresentou um menor número de condrócitos normais e lacunas preenchidas. Ainda, a técnica por CL (1,65 ± 0,47) revelou uma maior área de AgNOR/célula quando comparado ao controle (1,07 ± 0,14) e VSS (1,30 ± 0,31). Após o cultivo in vitro dos tecidos somáticos, não foi observada diferença após a análise da viabilidade celular e atividade metabólica, demonstrando uma eficiência das técnicas empregadas. Embora isso tenha ocorrido, as células pertencentes aos tecidos da VSS (34,1 h ± 2,9) necessitaram de um maior tempo para duplicar­se quando comparado ao controle (19,6 h ± 4,3) e CL (24,4 h ± 2,9). Quanto aos níveis apoptóticos, foi observado que a CL continha um maior número de células em apoptose tardia (22,3 ± 4,2) e necróticas (5,6 ± 2,2) quando comparado a técnica por VSS (5,8 ± 1,6; 0,4 ± 0,3, respectivamente). Em síntese, os protocolos de criopreservação foram eficientemente empregados em pele e cartilagem auricular de G. spixii. Contudo, considerando a manutenção da arquitetura estrutural do tecido após a avaliação por histologia e cultivo in vitro, a técnica por VSS se destaca em virtude da sua fácil execução, baixo custo e por oferecer a possibilidade de aplicação em campo. Portanto, com essas informações, foi possível compreender algumas das etapas envolvidas para a formação de bancos somáticos para o G. spixii.