Estratégias para conservação de células e tecidos somáticos de tatu-peba (Euphractus sexcinctus, Linnaeus, 1758) para o estabelecimento de biobancos

Abstract

Os bancos de recursos somáticos são ferramentas efetivas para a conservação ex situ in vitro de espécies silvestres, tais como o Euphractus sexcintus, um importante mamífero da América do Sul com interesse ecológico, econômico e científico. Para que esses bancos sejam eficientemente desenvolvidos é necessário seu estabelecimento adequado. Nesse contexto, o objetivo foi investigar as condições envolvidas na formação de biobancos de células e e tecidos somáticos de E. sexcintus, avaliando as condições de obtenção, cultivo in vitro, criopreservação e sincronização do ciclo. Para tanto, a tese foi dividida em três etapas. Na primeira etapa, visando o estabelecimento de bancos de tecidos somáticos, fragmentos de pele e cartilagem foram criopreservados comparando dois métodos (congelação lenta [CL] e vitrificação em superfície sólida [VSS]). Além disso, na VSS, duas combinações de crioprotetores (1,5M-EG [etilenoglicol] com 1,5M-DMSO [dimetilsulfóxido] vs. 3M-EG com 3M-DMSO) foram comparadas. A segunda etapa foi dividida em dois experimentos em que, visando o estabelecimento de bancos de células somáticas, as células foram comparadas quanto à duração do cultivo (4ª, 7ª, e 10ª passagem) e criotolerância (experimento 1), e a soluções de criopreservação contendo 10% de DMSO e diferentes concentrações de soro fetal bovino (SFB, 10% vs. 20% vs. 40%), na ausência e presença de 0,2 M de sacarose (experimento 2). Na terceira etapa, visando avaliar a funcionalidade celular, células foram submetidas à métodos de sincronização do ciclo em G0/G1 (privação de SFB vs. inibição por contato vs. 15 e 30 µM de roscovitina) por diferentes tempos. Na primeira etapa, CL e VSS (1,5M-EG + 1,5M-DMSO) não alteraram a estrutura dos tecidos quanto à espessura da derme e pele total; porém, somente os grupos VSS garantiram a preservação da espessura da cartilagem. Além disso, todos os tecidos criopreservados apresentaram padrões normais quanto à quantificação das células epidérmicas, melanócitos e fibroblastos, e foram capazes de recuperar células em cultivo, mantendo os parâmetros de qualidade semelhantes aos tecidos não criopreservados. Na segunda etapa, foram identificadas cinco linhagens fibroblásticas por morfologia, cariotipagem e imunofluorescência. O cultivo in vitro após todas as passagens, bem como a criopreservação não afetaram a maioria dos parâmetros avaliados, como a viabilidade, atividade proliferativa, atividade metabólica e os níveis apoptóticos. Contudo, células criopreservadas apresentaram um aumento na permeabilidade da membrana mitocondrial e tempo de duplicação celular quando comparado com células não criopreservadas. Quanto à avaliação da criopreservação em diferentes soluções, nenhuma diferença foi observada para a morfologia e viabilidade (> 90%) das células antes e após a criopreservação. Adicionalmente, a adição de sacarose foi positiva na manutenção da atividade metabólica e nos níveis apoptóticos em todas as concentrações de SFB. Contudo, concentrações 10% e 40% de SFB com sacarose apresentaram uma redução no potencial de membrana mitocondrial, enquanto os grupos de 20% de SFB na ausência ou presença de sacarose mantiveram esse parâmetro similar às células não submetidas à criopreservação. Portanto, o grupo 20% de SFB na presença de sacarose promoveu maior conservação das células após a criopreservação. Já na terceira etapa, nenhuma diferença foi observada para a morfologia e viabilidade (~72–97%) entre os métodos de sincronização em G0/G1. Os resultados mostraram que a privação de SFB aumentou a porcentagem de células na fase G0/G1 de maneira dependente do tempo, onde o grupo 72 h (90,5 ± 0,8%) e 120 h (90,1 ± 0,9%) apresentaram maiores taxas em comparação ao grupo 24 h (86,1 ± 0,9%) e controle (69,7 ± 0,8%). Contudo, a inibição por contato por 24 h, 72 h e 120 h e a roscovitina por 12–24 h não foram hábeis em promover a sincronização em G0/G1. Em conclusão, nossos resultados indicam as condições adequadas de obtenção, cultivo in vitro, criopreservação e sincronização em G0/G1 de amostras somáticas de E. sexcintus, visando o estabelecimento de biobancos para a espécie.