Efeito de diferentes meios no cultivo organotípico in vitro de fragmentos testiculares de catetos (Pecari tajacu linnaeus, 1758) adultos

Abstract

Esta dissertação objetivou definir um protocolo eficiente para o cultivo in vitro de tecido testicular de catetos adultos, de modo a viabilizar a utilização e a avaliação do germoplasma masculino previamente armazenado em biobancos. No primeiro capítulo foram investigados os efeitos de meios de cultura suplementados sobre a morfologia, viabilidade, apoptose e integridade do DNA de fragmentos testiculares de catetos adultos in vitro. Cinco testículos foram coletados, dissecados e cultivados em meios DMEM/F12, DMEM ou MEM. Esses meios foram suplementados igualmente com 10% de soro fetal bovino, 25 mM de HEPES, 2 μL/mL de insulina-transferrina-selênio (ITS), 1% de solução de aminoácidos não essenciais (NEAA), 1% de solução vitamínica, 0,2% de albumina sérica bovina, 1% de solução antibiótico-antifúngica, 10 ng/mL de LH/FSH, 20 ng/mL de mEGF, 10 ng/mL de GDNF e 10 ng/mL de bFGF. Os fragmentos foram cultivados em um sistema organotípico em gel de agarose a 0,75% por 7 e 14 dias a 34 °C e 5% de CO₂. O tempo de cultivo reduziu os escores morfológicos em comparação com o controle fresco (P < 0,05). O meio MEM apresentou melhor preservação morfológica da vacuolização da membrana em 7 dias e de todos os parâmetros em 14 dias. Por outro lado, o meio DMEM apresentou maior estabilidade temporal, garantindo um microambiente mais consistente. A viabilidade celular foi mantida, sem diferenças entre os tratamentos (P > 0,05). As taxas de apoptose mantiveram-se constantes, sugerindo equilíbrio celular ao longo do experimento. O meio MEM preservou melhor a integridade do DNA por até 7 dias, enquanto o meio DMEM manteve a estabilidade por 14 dias. Em conclusão, os meios MEM e DMEM, quando adequadamente suplementados, são adequados para o cultivo organotípico de tecido testicular de catetos adultos por até 14 dias. No segundo capítulo, investigaram-se os efeitos de diferentes meios de cultura suplementados na morfologia, viabilidade celular e apoptose de fragmentos testiculares de catetos adultos previamente criopreservados e posteriormente cultivados in vitro. Cinco testículos foram coletados, dissecados e cultivados em meios DMEM/F12 e DMEM. Ambos os meios receberam suplementação idêntica, contendo 10% de soro fetal bovino, 25 mM de HEPES, 2 μL/mL de insulina-transferrina-selênio (ITS), 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA), 1% de solução vitamínica, 0,2% de albumina sérica bovina, 1% de solução antibiótico-antifúngica, 10 ng/mL de LH/FSH, 20 ng/mL de mEGF, 10 ng/mL de GDNF e 10 ng/mL de bFGF. Fragmentos testiculares foram cultivados em um sistema organotípico utilizando gel de agarose a 0,75% por períodos de 7 e 14 dias, sob condições controladas de 34 °C e atmosfera contendo 5% de CO₂. O tempo de cultivo reduziu significativamente os escores morfológicos em comparação com o controle fresco e criopreservado (P < 0,05). Após 7 dias de cultivo, o meio DMEM proporcionou melhor preservação morfológica, especialmente nos parâmetros de separação da membrana basal e estrutura tubular; entretanto, após 14 dias, não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre as avaliações dos meios. A predição celular permaneceu estável ao longo do experimento, sem diferenças entre os tratamentos (P > 0,05). Da mesma forma, as proporções de células apoptóticas permaneceram constantes durante todo o período experimental, mantendo a homeostase celular. Em conclusão, os meios DMEM/F12 e DMEM, quando suplementados adequadamente, mostraram-se adequados para o cultivo organotípico de tecido testicular de catetos adultos, a partir de amostras previamente criopreservadas por até 14 dias.