Conservação de tecido somático de peixe-boi marinho, Trichechus Manatus Manatus (Linnaeus, 1758) usando diferentes técnicas e soluções de criopreservação

Abstract

Os criobancos de tecidos somáticos são importantes ferramentas para a conservação e conhecimento das espécies, especialmente aquelas ameaçadas de extinção como o peixe-boi marinho, que vem tendo sua população reduzida por ações antrópicas. Assim, faz-se necessário a otimização de protocolos para redução de danos ocasionados pelas técnicas de criopreservação. Diante deste cenário, o presente trabalho teve como objetivos avaliar o potencial da criopreservação para tecidos somáticos de peixe-boi marinho (Etapa 1), bem como aperfeiçoar o protocolo de vitrificação (Etapa 2). Para tanto, foram coletados fragmentos oriundos da pele de seis peixes-boi marinho mantidos no Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Mamíferos Aquáticos, na Ilha de Itamaracá, Pernambuco, e divididos em duas etapas. Na primeira etapa, fragmentos foram distribuídos nos grupos congelação lenta (CL) e vitrificação em superfície sólida (VSS). Já na segunda etapa, fragmentos foram alocados nos grupos vitrificados com diferentes soluções: 3M-EG+3MDMSO, 1,5M-EG+1,5M-DMSO, 3M-EG e 3M-DMSO. Tecidos não criopreservados foram utilizados como grupo controle nas duas etapas. Para todos os experimentos, fragmentos foram avaliados quanto à ultraestrutura, espessura da derme, quantificação de fibroblastos, percentual de fibras colágenas e potencial proliferativo tecidual. Além disso, células resultantes dos explantes cultivados foram avaliadas quanto à morfologia, aderência, viabilidade, atividade proliferativa, atividade metabólica, níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs), potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) e níveis de apoptose. Na primeira etapa, a VSS não alterou a espessura da derme (P > 0,05), mas, ambas as técnicas diminuíram a quantidade de fibroblastos e aumentaram o percentual de fibras colágenas (P < 0,05). A CL manteve o potencial proliferativo tecidual, semelhante aos tecidos não criopreservados. No cultivo in vitro, apenas fragmentos do grupo VSS não apresentaram crescimento celular no período de 60 dias. Para o grupo CL, células obtidas não apresentaram redução na sua viabilidade e atividade proliferativa (P > 0,05), entretanto, houve redução no metabolismo e aumento dos níveis de apoptose, EROs e ΔΨm em comparação com células de tecidos não criopreservados. Já na segunda etapa, não houve diferença na ultraestrutura, sendo observado aumento na espessura da derme no grupo 1,5M-EG+1,5M-DMSO. Em todos os grupos vitrificados houve redução nos fibroblastos e aumento da matriz colágena (P < 0,05). Contudo, a vitrificação com 3,0M-EG+3,0M-DMSO manteve o potencial proliferativo dos tecidos. Nenhum dos fragmentos vitrificados foram capazes de produzir células em cultivo in vitro. Em conclusão, tecidos somáticos de peixe-boi marinho podem ser criopreservados por congelação lenta, produzindo células viáveis após cultivo in vitro. Os tecidos quando vitrificados, mesmo com redução na concentração, bem como a associação dos crioprotetores intracelulares não permitiram a obtenção de células, o que evidencia necessidade do aperfeiçoamento de protocolos, visando aumentar a qualidade dos bancos de tecidos somáticos nesta espécie