Desenvolvimento e aplicação de dispositivo microfluídico tratado com plasma atmosférico frio na seleção de espermatozoides epididimários de carneiros

Abstract

A seleção de espermatozoides viáveis é uma etapa crucial durante a produção in vitro de embriões, entretanto, os atuais métodos para isso envolvem centrifugação e podem ser prejudiciais às células. Por essa razão, estão sendo estudados dispositivos microfluídicos que permitem a seleção dos espermatozoides sem interferências externas. O polidimetilsiloxano (PDMS) é o material mais utilizado na confecção de dispositivos microfluídicos, porém é extremamente hidrofóbico, dificultado o preenchimento de canais do dispositivo. Até o momento não há estudos com seleção espermática em carneiros, assim como não há estudos avaliando a influência da aplicação do plasma atmosférico nos dispositivos microfluídicos. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi definir parâmetros para aplicação do plasma atmosférico para modificação de superfície de PDMS e avaliar a eficiência de um dispositivo microfluídico na seleção de espermatozoides de carneiros a partir da quimiotaxia. Para o primeiro experimento, foram fabricados discos de PDMS que receberam o tratamento com plasma e foram avaliados após 0h, 3h, 6h, 9h e 24h para molhabilidade. Após isso, foram fabricados dispositivos microfluícidos com PDMS para o segundo experimento, que possuíam um reservatório de entrada interligado a três reservatórios de saída. O grupo controle consistiu em dispositivos não tratados, enquanto o grupo tratamento correspondia aos dispositivos tratados com plasma durante 15 minutos. Imediatamente após a aplicação, os dispositivos eram preenchidos com três meios diferentes nos reservatórios de saída, sendo eles: meio de FIV, solução NaCl 0,9%, e meio de MIV. Após isso, o reservatório de entrada foi preenchido com amostra de espermatozoides epididimários de carneiro. O dispositivo foi incubado por 35 minutos e, posteriormente, as amostras foram coletadas para avaliar os parâmetros de motilidade através do CASA, morfologia com uso de rosa bengala, e viabilidade e integridade, através de microscopia de fluorescência e teste hisposmótico, respectivamente. Os dados foram expressos em valores de média ± desvio padrão. Primeiramente, os dados foram examinados quanto à normalidade usando o teste de Shapiro-Wilk e para a homocedasticidade usando teste de Levene. Diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05. Em relação à molhabilidade, foi possível verificar que a aplicação do plasma atmosférico alterou a superfície de PDMS para altamente hidrofílica até 3 horas (27,31º ± 5,61º) após a aplicação do plasma (p < 0,05). Com o passar do tempo verificou-se que o ângulo de contato apresentou aumento gradual, porém ainda inferior ao avaliado antes do tratamento (86,31º ± 8,16º). Já em relação à seleção espermática, observou-se que o meio FIV do grupo tratamento apresentou parâmetros superiores para motilidade total (58,4 ± 16,9) e motilidade progressiva (43,9 ± 18,9) em relação aos demais meios testados (p < 0,05) e sendo semelhante com as amostras selecionadas pelo gradiente de Percoll em todos os parâmetros. Além disso, a aplicação do plasma atmosférico não influenciou na seleção de espermatozoides, ou seja, o uso ou não do plasma atmosférico não causa melhorias ou facilidade na seleção. Dessa forma, a confecção de um novo dispositivo microfluídico foi eficiente na seleção de espermatozoides de carneiros quando comparado ao gradiente de Percoll.