Estabelecimento das condições de seleção e capacitação espermática, meios de fertilização e de cultivo embrionário em Dasyprocta leporina (Linnaeus, 1758)

Abstract

As tecnologias de reprodução assistida (TRAs) desempenham um papel fundamental na conservação de espécies silvestres, como a cutia-vermelha (Dasyprocta leporina Linnaeus, 1758), um roedor de grande importância ecológica em virtude do seu papel na dispersão de sementes no continente sul-americano. Essas tecnologias oferecem abordagens inovadoras para superar desafios reprodutivos, contribuindo para a preservação da diversidade genética dessas espécies. Nesse contexto, a compreensão dos processos de desenvolvimento embrionário em ambientes controlados in vitro torna-se essencial. Contudo, técnicas reprodutivas avançadas, como a fertilização in vitro (FIV), ainda carecem de estudos específicos voltados à elucidação das etapas iniciais envolvidas na manipulação dos gametas. Diante desse cenário, o presente estudo teve como objetivo investigar os processos reprodutivos da cutia-vermelha in vitro, especificamente a seleção e capacitação espermática, co-incubação de gametas e suplementação do meio de cultivo, a fim de aprofundar o conhecimento sobre sua biologia reprodutiva e, consequentemente, otimizar o desenvolvimento embrionário em sistemas de reprodução assistida. Para alcançar esses objetivos, a tese foi estruturada em quatro etapas. Na primeira etapa, foram comparados diferentes métodos de seleção espermática – gradiente de densidade, swim-up e centrifugação – visando identificar a técnica mais eficiente na melhoria da capacidade fecundante e viabilidade espermática para a FIV. A segunda etapa investigou os efeitos de agentes capacitantes, avaliando perfis de BSA de baixa e alta concentração (4 ou 15 mg/mL), na presença ou ausência de cloreto de cálcio (CaCl₂), ao longo de diferentes tempos de incubação (1, 3 ou 6 h). Na terceira etapa, foi analisada a influência do meio de cultivo na FIV, comparando os meios HTF, TYH e TALP quanto ao seu impacto sobre o desenvolvimento embrionário. Finalmente, a quarta etapa avaliou o meio mais adequado para o desenvolvimento embrionário, comparando SOF e KSOM, tanto para embriões produzidos por FIV quanto para aqueles obtidos por ativação oocitária artificial (AA). Os resultados da primeira etapa indicaram que todos os métodos de seleção foram eficazes na obtenção de espermatozoides viáveis para a FIV; porém, a centrifugação destacou-se por selecionar gametas com melhores parâmetros cinéticos, morfológicos e funcionais, além de manter um equilíbrio oxidativo favorável in vitro. Na segunda etapa, a presença de CaCl₂ mostrou-se essencial para a viabilidade e funcionalidade espermática, reduzindo a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e promovendo altas taxas de capacitação (90,7%), reação acrossômica (93,8%) e hiperatividade (83,0%). Além disso, a menor concentração de BSA e as 6 h de incubação foram essenciais para maximizar os índices de capacitação nesta espécie. Os experimentos da terceira etapa indicaram que o meio TALP apresentou desempenho superior em relação aos meios HTF e TYH, proporcionando um ambiente com menor estresse oxidativo para embriões heterólogos. Esse efeito resultou no aumento das taxas de clivagem (71,1%), da proporção de embriões com ≥8 células (31,5%) e do desenvolvimento de mórulas (20,2%) após o desenvolvimento in vitro. Finalmente, a quarta etapa demonstrou que a combinação da FIV homóloga com o meio KSOM é a estratégia mais eficaz para a produção in vitro de embriões em cutias-vermelhas, resultando em maior qualidade dos zigotos (84,5%) e melhores taxas de desenvolvimento embrionário (clivagem total: 78,4%; mórula/clivados: 63,8%). Além disso, a AA apresentou desempenho superior na formação de mórulas no CIV com o KSOM (58,4%). Esse estudo também documentou, pela primeira vez, a produção in vitro de blastocisto em cutias (1,7%) no grupo FIV-KSOM. Em conclusão, os resultados deste estudo representam um passo importante no entendimento da biologia reprodutiva para a espécie e poderão servir como base para novos estudos voltados à reprodução assistida, com o propósito de preservar e auxiliar na continuidade das populações de cutias-vermelhas na América do Sul.