Cultivo in vitro de tecido ovariano canino por curto período como método avaliativo de diferentes técnicas de criopreservação

A vitrificação é uma biotécnica reprodutiva em crescimento, sendo considerada um dos métodos de criopreservação para conservação de tecido ovariano. O presente estudo objetivou avaliar os efeitos da vitrificação utilizando o ovarian tissue cryosystem (OTC) e a vitrificação em agulha adaptada (VIA) sobre a viabilidade e morfologia dos folículos ovarianos pré-antrais (FOPAS) inclusos no tecido ovariano de cadelas após o cultivo in vitro. Para tanto, cinco pares de ovários de fêmeas adultas foram coletados, fragmentados, destinados aos diferentes protocolos de vitrificação mencionados. Tanto os fragmentos a fresco (controle) quanto aqueles vitrificados em VIA ou OTC, e posteriormente aquecidos foram submetidos ao cultivo in vitro por 3 e 9 dias. Assim, os fragmentos do grupo controle fresco, controle fresco cultivado por 3 e 9 dias, bem como os grupos criopreservados: OTC aquecido, OTC cultivado 3 e 9 dias, VIA aquecida, VIA cultivada 3 e 9 dias, foram avaliados quanto à viabilidade folicular utilizando azul de tripan 0,4%, classificados como viáveis e inviáveis. Para análise da morfologia folicular, os fragmentos foram fixados em paraformaldeído 4%, destinados a histologia clássica e classificados como primordial, primário ou secundário, bem como em viáveis ou degenerados. Para avaliação tridimensional do tecido, os fragmentos foram fixados em glutaraldeído 2,5%, imersos em tetróxido de ósmio a 1% e desidratados em série crescente de álcoois. Os resultados foram expressos como média e erro padrão. Os resultados foram expressos como média e erro padrão com P < 0,05. Desse modo, obteve-se que o tratamento controle fresco apresentou 77,2 ± 2,81 % (P < 0,05) de viabilidade e não diferiu dos demais, sendo eles controle fresco cultivado por 3 (67,3 ± 6,49 %) e 9 (72,6 ± 1,79 %) dias, além do OTC e VIA aquecidos (85,7 ± 3,58 % e 75,7 ± 2,78 %, respectivamente) e OTC cultivado por 3 (81,3 ± 5,51 %) e 9 (64,6 ± 16,2 %) dias e VIA cultivado por 3 (70,6 ± 4,23 %) e 9 (72,8 ± 7,24 %) dias. Na morfologia, os folículos primordiais não diferiram entre os grupos controle fresco (85,5 ± 7,3%), controle fresco cultivado por 3 dias (81,1 ± 7,0 %), e dos grupos criopreservados aquecidos: OTC aquecido (91,7,0 ± 5,4 %), OTC cultivado 3 dias (52,6 ± 15,4 %), VIA adaptada aquecido (82,1 ± 7,1 %), VIA adaptada cultivado 3 dias (62,7 ± 20,4%) e 9 dias (63,6 ± 6,7 %) (P < 0,05). O controle fresco cultivado por 9 dias (70,1 ± 11,0 %) não diferiu destes nem do grupo OTC cultivado 9 dias (34,1 ± 9,0 %), mas este diferiu dos demais tratamentos (P < 0,05). O mesmo foi observado quanto aos folículos primários, ou seja não diferiu entre os grupos controle fresco (60,1 ± 11,5 %), controle fresco cultivado por 3 (63,6 ± 21,7 %) e 9 (60,7 ± 16,7 %) dias, e dos grupos criopreservados aquecidos: OTC aquecido (73,3 ± 19,4 %), OTC cultivado 3 dias (39,6 ± 15,7%), VIA adaptada aquecido (86,8 ± 6,0 %), VIA adaptada cultivado 3 dias (58,3 ± 30,0 %) e 9 dias (25,0 ± 25,0 %) (P < 0,05). O grupo OTC cultivado sofreu uma queda significativa (P < 0,05) na integridade morfológica, assemelhando-se apenas ao OTC cultivado 3 dias. Não foi observada diferença quanto aos folículos secundários entre os grupos controle fresco (22,9 ± 19,5%), controle fresco cultivado por 3 (15,0 ± 15,0 %) e 9 (20,0 ± 20,0 %) dias, e dos grupos criopreservados aquecidos: OTC aquecido (30,0 ± 20,0 %), OTC cultivado 3 dias (0,0 ± 0,0 %), VIA adaptada aquecido (0,0 ± 0,0 %), VIA adaptada cultivado 3 dias (0,0 ± 0,0 %) e 9 dias (25 0,0 ± 0,0) (P < 0,05). ). Na ultraestrutura, observou-se desorganização das células estromais nos tratamentos OTC cultivado por 3 e 9 dias comparado ao grupo controle fresco e fresco cultivado por 3 e 9 dias. Em conclusão, esse trabalho inova ao mostrar a aplicação do cultivo in vitro para o tecido ovariano de cadelas, sendo sugestivo que a VIA apresenta-se como a técnica mais adequada para vitrificação do tecido ovariano de cadelas em comparação ao OTC, por manter a viabilidade e morfologia folicular.