Criopreservação de tecido testicular de cães pré-púberes utilizando diferentes métodos de vitrificação

Abstract

Entre os canídeos, há muitas espécies ameaçadas de extinção, sendo sugestiva a formação de bancos de germoplasma para auxiliar na conservação de seu valioso material genético. Neste sentido, o cão doméstico tem servido como um importante modelo experimental para o aperfeiçoamento de biotecnologias reprodutivas. Em casos de animais pré-púberes ou naqueles que morreram subitamente, uma das principais opções disponíveis para a preservação do material genético masculino é a criopreservação do tecido gonadal. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos de diferentes métodos de vitrificação sobre a conservação do tecido testicular de cães pré-púberes. Foram utilizados cinco cães machos com idade entre 3 e 6 meses, dos quais foram coletadas cirurgicamente as gônadas. Os testículos foram fragmentados, separando-se um fragmento para controle a fresco. Os demais fragmentos foram criopreservados por diferentes métodos de vitrificação: em superfície sólida (VSS), imersão em agulhas (VIA), em criotubos e com Ovarian Tissue Cryosystem (OTC). As amostras a fresco ou vitrificadas foram processadas e coradas em Hematoxilina-Eosina para análise morfológica dos túbulos seminíferos. Para análise da viabilidade, as células do tecido testicular foram marcadas com as sondas fluorescentes iodeto de propídio e Hoechst, e analisadas em microscopia de epifluorescência. Para a avaliação do potencial proliferativo, os fragmentos foram fixados em paraformaldeido e corados em uma solução de nitrato de prata, sendo contadas as regiões organizadoras de nucléolos (RONs). Após reaquecimento, verificou-se que todos os métodos de vitrificação foram eficientes na preservação da integridade da membrana basal. No tocante à distinção celular, houve uma redução significativa no grupo vitrificado, quando comparado ao fresco. No entanto, as amostras submetidas à vitrificação em criotubos apresentaram resultados superiores de distinção celular (2,10 ± 0,04) e visualização nuclear (2,11 ± 0,04) quando comparados aos métodos de VSS (1,77 ± 0,04 e 1,76 ± 0,05) e VIA (1,75 ± 0,04 e 1,90 ± 0,03), diferindo da vitrificação em OTC apenas na distinção celular (1,99 ± 0,05). Em relação à viabilidade, todas as amostras submetidas ao procedimento de vitrificação sofreram uma redução da viabilidade, quando comparadas ao grupo fresco (83 ± 3,27%). As amostras criopreservadas por VSS (51,8 ± 3,80%), VIA (52,3 ± 4,13%) e vitrificação em criotubos (41,8 ± 5,42%) apresentaram viabilidade superior às vitrificadas em OTC (35,5 ± 7,47%). A quantificação de RONs das espermatogônias mostrou que os grupos submetidos a VSS (3,79 ± 0,04), criotubos (3,78 ± 0,04) e OTC (3,87 ± 0,04) foram semelhantes ao grupo fresco (3,77 ± 0,03), enquanto na VIA (3,97 ± 0,05) o número foi superior (P < 0.05). Em relação as células de Sertoli, a quantificação das RONs nos grupos vitrificados em criotubos (3,51 ± 0,05) e em OTC (3,41 ± 0,04) foi semelhante ao grupo fresco (3,45 ± 0,03); no entanto, houve um aumento significativo do número de RONs das amostras submetidas a VSS (3,62 ± 0,04) e VIA (3,88 ± 0,05). Dessa forma, sugere-se o uso da vitrificação em criotubos para a preservação da morfologia, viabilidade e potencial proliferativo celular no tecido testicular de cães pré-púberes. Além disso, o OTC também pode ser utilizado, possibilitando a manutenção das características morfológicas e capacidade de multiplicação das células germinativas.