Expansão, criopreservação e sincronização em G0/G1 de fibroblastos para aplicações biotecnológicas visando a conservação do gato-do-mato-pequeno (Leopardus tigrinus Schreber, 1775)

Abstract

O gato-do-mato-pequeno é um mesopredador que auxilia no equilíbrio de seu habitat por meio do controle de suas presas. Contudo, ele tem sofrido constantes ameaçadas, sendo considerado uma espécie vulnerável à extinção. Neste contexto, bancos de células somáticas associados às ferramentas de reprogramação nuclear tornam-se essenciais para a conservação da espécie. Portanto, o objetivo foi comparar o efeito do número de passagens, crioprotetores e métodos de sincronização em G0/G1 de fibroblastos de gato-do-mato-pequeno. Para tanto, células somáticas derivadas da pele de quatro animais provenientes de zoológicos, foram identificadas como fibroblastos por ensaios de imunocitoquímica e com cariótipo normal por cariotipagem. Em seguida, fibroblastos foram distribuídos em três experimentos. No primeiro experimento, fibroblastos foram cultivados por diferentes passagens (terceira, sexta e décima primeira) e submetidos à criopreservação. No segundo experimento, células foram criopreservadas por congelação lenta em diferentes concentrações de dimetilsulfóxido (2,5 e 10% de DMSO), na ausência e presença de 0,2 M de sacarose ou 100 mM de L-prolina, e avaliadas antes e após a criopreservação. Em ambos os experimentos, células foram avaliadas quanto à morfologia, viabilidade, atividade metabólica, atividade proliferativa, níveis das espécies reativas de oxigênio (EROs), potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), e níveis apoptóticos. Exclusivamente no primeiro experimento, células foram avaliadas em sistema sem antibiótico, e análise ultraestrutural. No terceiro experimento, fibroblastos foram submetidos à sincronização em G0/G1, onde foram avaliados após diferentes condições [incubação com roscovitina a 7,5 e 15 µM (24 e 48 h), inibição por contato (24–72 h) e privação de soro fetal bovino (24–96 h)]. Neste experimento, células foram avaliadas quanto à morfologia, viabilidade, níveis de apoptose e capacidade de sincronização em G0/G1. No primeiro experimento, foi observada uma redução na atividade metabólica e ΔΨm na sétima e décima-primeira passagem, bem como a décima primeira passagem resultou na redução da proliferação celular e modificações morfológicas. Demais parâmetros não foram alterados. No segundo experimento, 10% de DMSO apresentou os melhores resultados promovendo manutenção da viabilidade imediatamente após a descongelação e níveis de EROs. No terceiro experimento, a privação de soro fetal bovino foi o único método que promoveu aumento na taxa de células em G0/G1 de 86,0% ± 0,9 para 91,4% ± 1,7; contudo, ele reduziu o número de células viáveis de 99,8% ± 0,3 para 93,3% ± 0,6. Os demais grupos [roscovitina e inibição por contato] não aumentaram as taxas de células em G0/G1. Em conclusão, células de gato-do-mato-pequeno apresentaram danos em sua proliferação a partir da sétima passagem. Ainda, tais células demonstraram que podem ser criopreservadas com 10% de DMSO, apresentando alta viabilidade após a descongelação. Finalmente, a privação com soro demonstrou ser o método capaz de sincronizar células em G0/G1. Adicionalmente, o estabelecimento dessas etapas possibilitará os próximos passos para aplicação de células de gato do-mato-pequeno visando sua conservação.