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metadata.dc.type: Trabalho de Conclusão de Curso
Title: Padronização da técnica de aglutinação em látex para o diagnóstico indireto da leptospirose: preparo do antígeno recombinante
metadata.dc.creator: Araújo, Bruno Vinicios Silva de
metadata.dc.contributor.advisor1: Sakamoto, Sidnei Miyoshi
metadata.dc.contributor.referee1: Braga, Juliana Fontes Valarinho
metadata.dc.contributor.referee2: Oliveira, Jéssica Costa de
metadata.dc.description.resumo: A Leptospirose é considerada a antropozoonose mais amplamente difundida no mundo. De acordo com a classificação sorológica, a espécie Leptospira interrogans contempla os sorovares patogênicos mais envolvidos em infecções que acometem o homem e os animais e a LipL32 é a mais abundante proteína transmembrana, sendo altamente imunogênica. A utilização de lipoproteínas, como a LipL32, pode representar uma alternativa de menor custo, maior segurança e especificidade para o desenvolvimento de testes sorológicos de diagnóstico. Diante disso, objetivou-se contribuir para o desenvolvimento de um teste diagnóstico rápido, de fácil interpretação e acessível em nível ambulatorial que possa diagnosticar em minutos a leptospirose humana e animal em qualquer fase da infecção. Foram submetidos à amplificação do gene da lipoproteína LipL32 o DNA genômico extraído de cepas padrão de 19 leptospiras patogênicas (sorovar Australis, Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Castellonis, Copenhageni, Cynopteri, Djasiman, Grippotyphosa, Guaricura, Hardjobovis, Hebdomadis, Icterohaemorrhagiae, Panamá, Pomona, Sejroe, Tarassovi, Wolfii). Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação deste gene foram validados em trabalhos já publicados, de acordo com Seixas et al. (2007) e Amutha et al. (2007). Os produtos da amplificação pela PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1%, em tampão Tris-Acetato-EDTA (TAE), utilizando o brometo de etídeo (0,5mg/mL), como corante evidenciador do DNA. Os primers tinham, em suas extremidades 5’, sítios de restrição para as enzimas EcoR I e Kpn I, para permitir a inserção no sentido correto no plasmídeo recombinante. O vetor recombinante utilizado neste estudo já havia sido previamente construído, pAE / lipL32 (SEIXAS, et al., 2007). As cepas utilizadas foram as linhagens de E. coli XL1-Blue, BL21(DE3) PLys e E. coli BL21 Star™ (DE3). A E. coli XL1-Blue foi utilizada para a clonagem e a BL21(DE3) PLys e E. coli BL21 Star™ (DE3) foram utilizadas para a expressão das proteínas recombinantes. Foi realizado o preparo de bactérias competentes por CaCl2, transformação de bactérias E. coli XL1-Blue, cultivo das células transformadas, extração de plasmídeos, transformação das Células de expressão, crescimento do inóculo e indução da expressão por isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, extração da proteína recombinante por lise celular por sonicador e a análise da proteína LipL32 por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE. Das 19 amostras submetidas a PCR direcionada ao gene da lipoproteína LipL32, todas apresentaram positividade, resultando na amplificação de uma região de 756 pb e 771 pb. O que era esperado, tendo em vista que a LipL32 é codificada por um gene conservado entre as espécies patogênicas de Leptospiras. Após a realização da PCR das alíquotas provenientes das unidades formadoras de colônias (UFCs) que apresentavam a coloração branca, foi detectada positividade para amplificação do gene LipL32. Evidenciando alta taxa de transformação na linhagem de E. coli XL1-Blue e sucesso na clonagem do gene LipL32 de Leptospira para expressão heteróloga do peptídeo correspondente. As amostras provenientes do protocolo de expressão utilizando a Cepa bacteriana E. coli BL21(DE3) PLys foram sonicadas, e as alíquotas, utilizadas para verificar o tempo em que a proteína foi expressa em maior concentração pela bactéria, através de uma eletroforese em um SDS-PAGE. Houve sucesso na expressão da proteína LipL32 recombinante mas são necessários ajustes para melhorar o rendimento da extração. A cepa bacteriana E. coli BL21 Star™ (DE3), não apresentou taxa de transformação, e consequentemente expressão da proteína heteróloga
Abstract: Leptospirosis is seen as the most widespread anthropozoonosis in the world. According to the serological classification, the species Leptospira interrogans includes the pathogenic serovars mostly involved in infections that affect man and animals, being LipL32 the most abundant and highly immunogenic transmembrane protein. The use of lipoproteins, such as LipL32, may represent a lower cost, higher safety and specific alternative for the development of serological diagnostic tests. Thus, the objective was to contribute to the development of a rapid diagnostic point of care test, easily to read and interpret that can diagnose human and animal leptospirosis in minutes at any stage of infection. Genomic DNA extracted from standard strains of 19 pathogenic leptospires (serovar Australis, Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Castellonis, Copenhagen Panama, Pomona, Sejroe, Tarassovi, Wolfii). The oligonucleotides primers used for amplification of this gene have been validated in published studies, according to Seixas et al. (2007) and Amutha et al. (2007). PCR amplification products were submitted to 1% agarose gel electrophoresis in Tris-Acetate-EDTA (TAE) buffer, using ethidium bromide (0.5mg / mL) as DNA evidencing dye. The primers had, at their 5 'ends, restriction sites for the EcoR I and Kpn I enzymes, to allow insertion in the right direction into the recombinant plasmid. The recombinant vector used in this study had been previously constructed, pAE / lipL32 (SEIXAS, et al., 2007). The strains used were E. coli XL1-Blue, BL21 (DE3) PLys and E. coli BL21 Star ™ (DE3) strains. E. coli XL1-Blue was used for cloning and BL21 (DE3) PLys and E. coli BL21 Star ™ (DE3) were used for expression of recombinant proteins. CaCl2 competent bacteria preparation, E. coli XL1-Blue bacterial transformation, transformed cell culture, plasmid extraction, expression cell transformation, inoculum growth and isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside expression induction were performed. Recombinant protein extraction by sonicator cell lysis and LipL32 protein analysis by SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis. Of the 19 samples submitted to PCR directed to lipoprotein gene LipL32, all were positive, resulting in amplification of a region of 756 bp and 771 bp as expected given that LipL32 is encoded by a conserved gene among the pathogenic Leptospira species. After selection of white colony forming units (CFUs), the presence of LipL32 gene was detected by PCR amplification. Evidence of high transformation rate in E. coli XL1-Blue strain and successful cloning of Leptospira LipL32 gene for heterologous expression of the corresponding peptide. Samples from the expression protocol using the E. coli BL21 (DE3) PLys bacterial strain were sonicated and the aliquots used to verify the time the protein was expressed in the highest concentration by the bacterium by electrophoresis on an SDS-PAGE. LipL32 protein was successfully expressed however adjustments to improve protein extraction level are needed. The bacterial strain E. coli BL21 Star ™ (DE3) showed no transformation rate and consequently no heterologous protein expression.
Keywords: Leptospira
LipL32
Diagnóstico
Leptospira
LipL32
Diagnosis
metadata.dc.subject.cnpq: CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::MEDICINA VETERINARIA
metadata.dc.language: por
metadata.dc.publisher.country: Brasil
Publisher: Universidade Federal Rural do Semi-Árido
metadata.dc.publisher.initials: UFERSA
metadata.dc.publisher.department: Centro de Ciências Agrárias - CCA
Citation: Araújo (2019) (ARAÙJO, 2019)
metadata.dc.rights: Acesso Aberto
URI: http://repositorio.ufersa.edu.br/handle/prefix/4762
Issue Date: 13-Aug-2019
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